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烷基糖苷对赤潮生物的抑制与灭杀作用的实验

2019-7-8 10:29:26点击:
      利用化学除藻剂抑制与灭杀赤潮生物是赤潮治理的方法之一,目前已有多种化学制剂用于赤潮生物治理的实验研究:如硫酸铜和缓释铜离子除藻剂、黏土、和改性黏土、臭氧、二氧化氯以及新洁尔灭、碘伏、异噻唑啉酮等有机除藻剂。近来,有将季铵盐类表面活性剂[8]和莎梵婷生物表面活性剂用于赤潮生物治理的相关报道。
      烷基糖苷( alkylpolyglycoside,简称APC)是20世纪90年代以来国际上致力开发的温和型表面活性剂。此类表面活性剂可利用再生性植物资源为原料合成,不仅有广谱的抗菌活性,而且还具有生物降解迅速、完全、对环境无污染等优点。本文试图以具齿原甲藻0201-01和赤潮异湾藻两种典型赤潮生物为例,探讨APG类表面活性剂对赤潮生物生长影响及灭杀作用,以期为开发该类化合物在有害赤潮治理中的应用奠定基础。
      1:材料与方法
      1.1  实验材料
      十二烷基葡萄糖苷[](由青岛科技大学提供);实验藻种为具齿原甲藻0201-01(由国家重点基础研究发展规划项目组( 2001CB409703)提供)和赤潮异湾藻(由中国海洋大学水产学院提供)。藻细胞在(22± 1)℃、3000 lx光照和12 h光暗循环条件下,于不加硅酸盐的f/2培养液中培养。
      1.2 实验方法
      为观察APG对赤潮生物生长的影响,取处于生长延滞期的具齿原甲藻0201-01和赤潮异湾藻,分别按照0、2.5、4.5、5.5、6.5、8.5mgL-以及0、5.0、7.5、10.0、12.5mgL'的浓度梯度添加APG并摇匀,置于LRH-250G光照培养箱(广州医疗器械厂)内培养,定时取样。采用Multisiz-e  TM3Coulter Counter计数仪( Beckman Coulter公司)进行细胞密度计数,同时在ALPHAPHOTYS显微镜(Nikon公司)下观察藻细胞形态变化。为了进一步探讨APG对赤潮生物的灭杀作用,在具齿原甲藻0201-01和赤潮异湾藻指数生长前期分别按10.5、12.5、15.0、18.0mg'L'及12.5、15.0、20.0、25.0mg'L'的浓度梯度添加APG。在其指数生长后期则分别按浓度梯度为12.5、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0 mg*L' 及15.0、20.0、25.0、30.0、35.0mg'L'添加APG并摇匀,置于光照培养箱内培养(双份平行实验),定时取样。于显微镜下血球计数板计数,同时观察藻细胞形态变化,并用A203数码相机(Fuji公司)拍照。
      2:结果与讨论
      2.1  APG对赤潮生物生长的影响
      APG对具齿原甲藻0201-01和赤潮异湾藻生长的影响结果如图1。从图可知,在整个实验.过程中,不同浓度的APG对两种赤潮生物的生长都表现出了显著的抑制作用,且作用效果随浓度的增大愈加明显。加入APG浓度为2.5-6.5mgL'时,具齿原甲藻的生长受到了明显抑制。

      当其浓度增加至8.5mg*l'时,具齿原甲藻的细胞密度迅速减小,基本不再生长(见图1a)。 对赤潮异湾藻而言,在7.5~ 12 5mg'L'APG作用下,藻细胞生长首先表现出滞钝反应,即藻细胞密度在加人APG24h内均呈下降趋势,之后藻细胞开始生长。但其生长较对照样藻细胞生长都有所减缓(见图1b)。APG对具齿原甲藻和赤潮异湾藻作用不同时间所对应的EC50值列于表1。
      表1表明APG对两种赤潮生物具有较强的抑制效果。在APG作用于赤潮生物24 h内,其对赤潮异湾藻生长的抑制效果比对具齿原甲藻生长的抑制效果更强,这由二者的24h-ΔEC50为负得以证实。此后,其对赤潮异湾藻生长的抑制效果却比对具齿原甲藻生长的抑制效果更弱(48h~96h-ΔEC50均为正)。可见,赤潮异湾藻对APG的作用反应较具齿原甲藻的反应更敏感,但APG对具齿原甲藻的作用效果却比对赤潮异湾藻的更持久。在随后APG对藻细胞灭杀作用的实验研究中也证实了这一点。

      2.2APG对指数生长前期赤潮生物的灭杀作用
      增大APG用量后,其对处于指数生长前期的藻细胞的灭杀作用的实验结果如图2所示,由图2a可知:当加入APG的浓度等于或大于10.5 mg"L'时,具齿原甲藻的细胞密度迅速下降。以18.0mg*工为例,具齿原甲藻在该浓度下的LT50为22.38h,即在24h以内对该藻细胞的去除率就已达到50%。显微镜观察不到具齿原甲藻细胞明显的形状变化,但其活动能力均受到了不同程度的损伤。同样以18.0mg*L=的APG为例,其作用于具齿原甲藻细胞仅8h后,就导致所有藻细胞丧失了运动能力。
      就赤潮异湾藻而言,当APG的浓度为15.0mg'L'或低于此浓度,该表面活性剂一开始对藻细胞的生长表现出滞钝作用,藻细胞密度均有不同程度下降,但随着时间的推移,藻细胞密度出现回升趋势(图2b)。

      如APG浓度为15.0 mg*LI时,其作用于该藻8h后,部分藻细胞丧失了运动性,藻细胞由近椭球形溶涨为球形(图3C),细胞密度逐渐下降。但这种效果仅维持了两天。此后,丧失运动性的藻细胞又恢复了运动性,其形状也基本恢复为正常的椭球形,藻细胞密度出现上升趋势。当APG的浓度超过15.0 mgLl时,赤潮异湾藻细胞密度则能以较快的速度下降(LT50值均小于15h),至藻细胞溶解消失。如APG的浓度为20.0、25.0 mg*L'时,其作用于藻细胞8 h后,所有藻细胞彻底丧失了运动性,并且有部分藻细胞已经破碎(如图3D)。


      之后藻细胞以较快的速度溶解消失,48 h后再镜检时,视野内基本上找不到藻细胞,此时对该藻细胞的去除率均已近100%。藻液由浅黄色变成近无色,继续培养数日也没有观察到藻细胞存在。究其杀藻机理,我们推测是因为APG是一类具有亲水性和亲脂性官能团的表面活性剂,它能与藻细胞膜中的亲脂和亲水基团相互作用,从而对藻细胞膜造成破坏,进而对细胞内的色素体线粒体、高尔基体和细胞核等细胞器造成损坏,最终导致藻细胞死亡。曹西华等研究证实了十六烷基三甲基溴化铵灭杀赤潮异湾藻的原因在于该表面活性剂破坏了藻细胞的细胞膜结构,导致细胞内细胞器、内溶物溢出,从而达到灭杀赤潮藻的功效。Ahn 等探讨含有莎梵婷生物表面活性剂的细菌C1发酵液对蓝藻细胞生长的影响时也认为,该生物表面活性剂的抑藻作用是由其对细胞膜结构的破坏所致。
      2.3APG对指数生长后期赤潮生物的灭杀作用
      为了探讨藻密度对APG杀藻效果的影响,本文还就APG对处于指数生长后期的藻细胞的灭杀作用进行了分析,其结果如图4。

      由图4与图2对比可知,APG对不同起始密度的藻细胞的作用趋势类似。只是随藻密度的增加,达到有效灭杀藻细胞所需APG的浓度相应要高。以赤潮异湾藻为例,APG的浓度达20.0mg* L'时,就能有效去除处于指数生长前期的藻细胞,对藻细胞的破坏表现为不可恢复型损坏。而要达到有效去除指数生长后期的藻细胞则需将APG的浓度增至25.0mg.L*。在相同浓度APG作用下,藻细胞起始密度越高相对应的LT50值也越高。同样以赤潮异湾藻为例,当APG的浓度为20.0mgL'时,有效去除50%处于指数生长后期藻细胞所需时间较去除50%处于指数生长前期藻细胞所需时间多近17h。该实验结果也表明治理赤潮应从预防.监测着手,一旦发生赤潮,应该立刻着手治理。
3:结论
      (1)APG的浓度高于2.5 mgL'时,对具齿原甲藻的生长有明显抑制作用,进一步增大APG的用量(达10.5mgL'时) ,对该藻细胞具有较强的灭杀功能。就赤潮异湾藻而言,当APG的浓度高于5.0mgL'时,对该藻细胞的生长也表现出了明显的抑制作用,当APG的浓度高于20.0mgL'时,可以有效的灭杀赤潮异湾藻细胞,对藻细胞的破坏表现为不可恢复型破坏。究其杀藻机理。我们推断是由于APG破坏了藻的细胞膜,进而对藻细胞内的细胞器造成破坏,最终导致藻细胞彻底崩解。
      (2)对比APG对具齿原甲藻和赤湖异湾藻作用效果可知:对不同赤潮生物而言,其起到抑制藻细胞生长及灭杀藻细胞的功效不尽相同。对同种一种赤潮生物而言,在赤潮生物起始密度低时投加APG的作用效果更为理想。
(3)APG是一种应用广泛的环保型表面活性剂,本文首次将其应用于赤朝生物治理的实验研究,其除藻效果较为理想,可以用于赤潮治理。